3.蔬菜中含硫揮發(fā)物(VSCs)的生物合成

蔬菜中VSCs的形成在蔥屬蔬菜中得到了廣泛的研究。第二組具有重要和豐富的VSCs的蔬菜是十字花科。這兩類蔬菜占主導(dǎo)地位，但S-甲基蛋氨酸衍生化合物是在蘆筍和其他蔬菜中形成的。蔥屬植物約有700種，其中大蒜(Allium sativum)和洋蔥(Allium cepa)是最重要的蔬菜，主要因其獨特的味道而受到贊賞。

洋蔥風(fēng)味的形成包括：(i)酶介導(dǎo)的非揮發(fā)性前體的降解;(ii)初級風(fēng)味化合物的二次反應(yīng);(iii)前體的熱降解。半胱氨酸作為一種含硫氨基酸，與谷氨酰胺一起在蔥類蔬菜風(fēng)味化合物的形成中起著至關(guān)重要的作用，(+)-S - 烷烴(烯烴)基半胱氨酸亞基(CSOs)及其γ-谷氨酰基肽(γGPs)是主要的非揮發(fā)性、無臭的前體[46]。關(guān)于風(fēng)味化合物及其前體生物合成的詳細綜述論文已經(jīng)發(fā)表[46-48]。

大蒜、洋蔥和其他蔥屬植物含有干重為1-5%的非蛋白含硫氨基酸(SAA)次生代謝物。細胞的破壞導(dǎo)致液泡中蒜氨酸酶(C-S裂解酶)的釋放，并與位于細胞質(zhì)[49]中的S-烷(烯)基-L-半胱氨酸S -氧化物(揮發(fā)性化合物前體)發(fā)生反應(yīng)。四種亞砜存在于蔥屬植物中：S-2-丙烯- L-半胱氨酸亞砜(大蒜素, ACSO)， S-(E)-1-丙烯-L-半胱氨酸亞砜(異蒜素，1-PeCSO)， S-甲基-L半胱氨酸亞砜(methiin，MCSO，也存在于蕓苔屬蔬菜中)，S-丙基-L-半胱氨酸亞砜(propiin，PCSO)。不同數(shù)量的這些前體[47]導(dǎo)致了蔥內(nèi)風(fēng)味的差異。根據(jù)Block的總結(jié)，用標記的35SO42-飼喂洋蔥植株的實驗，含硫的有機酸鹽在葉綠體中被還原并同化為半胱氨酸。然后谷氨酸摻入生成γ-谷氨酰胺半胱氨酸，γ-谷氨酰胺半胱氨酸與甲基丙烯酸(纈氨酸)反應(yīng)生成γ-谷氨酰胺-S-2-羧基丙基半胱氨酸，γ-谷氨酰胺-S-1-丙烯半胱氨酸可依次脫羧生成γ-谷氨酰胺-S-1-丙烯半胱氨酸，隨后氧化生成γ-谷氨酰胺-S-1-丙烯半胱氨酸-S-氧化物，并被γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶[EC 2.3.2.1]裂解為S-(E)-1-丙烯半胱氨酸S-氧化物[47]。

參與形成蔥揮發(fā)物——蒜氨酸酶[EC 4.4.1.4]——的主要酶是α、β消除裂解酶，催化上述S -氧化物分解為丙酮酸銨和蒜素及其相似物。亞磺酸是一種高度不穩(wěn)定的化合物，是洋蔥化學(xué)中酶催化形成的關(guān)鍵中間體。圖4總結(jié)了磺胺酸酶生成的初始階段。

圖4    酶促反應(yīng)形成蔥味化合物的初始階段。基于[47-49,51]。

假設(shè)大蒜和洋蔥的風(fēng)味成分主要包括S -烯丙基半胱氨酸亞砜(蒜素)；S-烯丙基-半胱氨酸；二烯丙基-、甲基烯丙基-和二丙基單硫化物、二硫化物、三硫化物和四硫化物的硫化物，都是由含硫前體——主要是S-烯基半胱氨酸亞砜(ACSO)通過酶介導(dǎo)的降解過程[48]產(chǎn)生的。大蒜素(C6H10OS2)是大蒜風(fēng)味的關(guān)鍵分子，負責(zé)新鮮切開或碾碎大蒜的典型氣味和味道。它占大蒜瓣[50]破碎過程中存在/形成的硫代亞磺酸化合物總量的70% (w/w)。大蒜素非常不穩(wěn)定，很容易轉(zhuǎn)化為二烯丙基硫化物(DAS)、二烯丙基二硫化物(DADS)、二烯丙基三硫化物(DATS)和二烯丙基四硫化物(DATTS)。

由于蔥的初級風(fēng)味化合物的不穩(wěn)定性，它們可以分解或縮合成次級風(fēng)味化合物一這些是從烷基硫代亞磺酸鹽中衍生出來的。大蒜素是最好的例子，其對pH值(>11)、溶劑和溫度敏感。當溫度超過50℃時，它會迅速分解為各種硫化物(主要是二烯丙基二硫化物DADS)。有學(xué)者研究了在不同水分和溫度的模型體系中加熱S-甲基-L-半胱氨酸和S-甲基-L-半胱氨酸亞砜，導(dǎo)致這些前驅(qū)體[53]揮發(fā)性分解產(chǎn)物的形成，有助于熱加工的蕓苔屬和蔥屬蔬菜的風(fēng)味形成。這些風(fēng)味的主要揮發(fā)性成分為二甲基硫化物。S-甲基半胱氨酸亞砜(MCSO)降解產(chǎn)物中還檢出了三硫二甲基、硫代亞磺酸二甲基、硫代磺化二甲基。二甲基三硫化物被認為是一種過熟蔬菜的不良風(fēng)味。Li和同事收集了大蒜和洋蔥中風(fēng)味前體的熱降解數(shù)據(jù)，根據(jù)這些數(shù)據(jù)， S-甲基-L半胱氨酸亞砜(MCSO)的主要降解產(chǎn)物是二甲基二硫化物，其次是二甲基三硫化物(120-160℃加熱后)；S-丙基-L-半胱氨酸亞砜(PCSO)的主要降解產(chǎn)物為異丙基二硫化物和二丙基三硫化物和丙基硫醇；和S-2-丙烯- L-半胱氨酸亞砜(ACSO)的主要降解產(chǎn)物為二烯丙基硫化物(單，二，三，四)，甲基硫化物，2-乙酰噻唑，和其他環(huán)狀化合物(2,5-二甲基-1,4-二噻烷，2-甲基-1,4-二噻烷和其他)[48]。

如前所述，在蕓苔屬植物中形成的含硫揮發(fā)性化合物主要來自于其前體——硫代葡萄糖苷的水解和降解。在[5]中討論了作為硫代葡萄糖苷降解產(chǎn)物的含硫揮發(fā)性化合物VSCs形成的詳細途徑。

硫代葡萄糖苷的苷元分解與反應(yīng)條件密切相關(guān)。當反應(yīng)環(huán)境為中性或微酸性(pH值為5 ~ 7)時，有利于植物組織中異硫氰酸酯(ITCs)的形成。ITCs分子由一個異硫氰酸酯基團(-N=C=S)上連接一個側(cè)鏈(-R)，可以用一般公式R-N=C=S表示(圖5)。

圖5  蕓苔屬蔬菜中硫代葡萄糖苷(GLSs)水解后主要揮發(fā)性化合物基團的形成ESP-上皮硫特異蛋白質(zhì);ESM-上皮硫修飾蛋白質(zhì);NSP-腈類特異蛋白質(zhì);TFP-硫腈酸鹽合成蛋白質(zhì);R-側(cè)鏈[6,54]。

有學(xué)者提出了在(+)-S - 烷烴(烯烴)基半胱氨酸亞基(CSO)裂解酶作用下，硫代亞磺酸鹽和硫代磺酸鹽與硫化氫反應(yīng)而在搗爛的白菜組織中產(chǎn)生甲硫醇和二甲基三硫化物的觀點，而二甲基硫化物則是由甲硫代亞磺酸甲酯[51]的化學(xué)歧化反應(yīng)產(chǎn)生的。二甲基二硫通常被檢測為新鮮搗爛的卷心菜組織頂空的主要揮發(fā)性含硫化合物，被認為是C-S裂解酶水解S-甲基-L-半胱氨酸亞砜(MCSO)的副產(chǎn)物，主要反應(yīng)產(chǎn)物是甲烷磺酸，它脫水生成更穩(wěn)定的甲基甲硫代亞磺酸甲酯，與二甲基二硫不成比例。可提出的替代機制涉及在有空氣存在的條件下甲烷硫醇氧化為二甲基二硫。二甲基三硫化物的形成是通過S-甲基-L-半胱氨酸亞砜裂解酶與單質(zhì)硫反應(yīng)得到的二甲基二硫化物或甲磺酸與硫化氫[51]反應(yīng)形成的。

Challenger and Hayward(1954)在蘆筍中發(fā)現(xiàn)了S-甲基甲硫氨酸，并證明它在食物儲存/熱處理過程中分解為二甲基硫化物，成為煮蘆筍、加工番茄、玉米和啤酒風(fēng)味的一部分(圖6)。S-甲基甲硫氨酸在番茄、卷心菜、球莖甘藍、甜菜根、芹菜和韭菜[55]中被發(fā)現(xiàn)的含量為2.8-176毫克/公斤。

圖6  S-甲基甲硫氨酸的熱降解

20世紀70年代，人們在蘆筍中鑒定出含硫有機酸，并將其作為芳香化合物的前體[56,57]。它們是1,2-二硫戊環(huán)-4-羧酸(蘆筍酸)，3,3-二巰基異丁酸(二氫蘆筍酸)和S-乙酰二氫蘆筍酸。研究發(fā)現(xiàn)，蘆筍中硫化物是在完整的植物細胞中形成的，這在硫化物的形成中是一個例外，硫化物通常是通過酶催化反應(yīng)形成的。在蘆筍中，檢測到13種含硫有機酸(其中以蘆筍酸為主)和3種酯(1,2-二硫戊環(huán)-4-羧酸甲酯為主)。在完成[U-14C]之后，標記實驗假設(shè)纈氨酸作為起始分子，通過相應(yīng)的含氧酸、異丁酸和甲基丙烯酸轉(zhuǎn)化為3-巰基異丁酸、3-甲基硫代異丁酸，以及較小程度的蘆筍酸[56]。在烹飪過程中，蘆筍產(chǎn)生的化合物屬于不同的化學(xué)類別:硫化合物(17)，吡咯，吡啶，吡嗪，呋喃(25)，醛(12)，酮(15)，醇(26)，酚(11)，內(nèi)酯(5)，酸(10)，二甲基硫化物和1,2-二硫戊環(huán)-4-羧酸甲酯(分別為3000 ppb和7000 ppb)。

蔬菜中的硫化物是由蛋氨酸或半胱氨酸分離或轉(zhuǎn)化其他含硫底物形成的，例如異硫氰酸酯重排反應(yīng)[58]。例如，屬于石蒜科家族的蔬菜在貯藏葉肉細胞的胞漿中含有S-烷(烯)基-L-半胱氨酸亞基，而蒜氨酸酶則被隔離在維管束鞘細胞的液泡中。硫化物的形成機制與硫代葡萄糖苷-黑芥子酶系統(tǒng)的形成機制相似。需要破壞組織才能讓酶接觸底物，然后產(chǎn)生一系列不穩(wěn)定的產(chǎn)物。磺胺酸被轉(zhuǎn)化為硫代亞磺酸鹽，最后轉(zhuǎn)化為硫化物的復(fù)雜混合物，其中單硫化物、二硫化物和多硫化物占主要地位。一些研究表明，硫化物的形成與工業(yè)過程所需的高溫加熱(例如在制備番茄醬或烹飪卷心菜[27]時)之間存在密切關(guān)系。工業(yè)過程影響的延伸將在以下各段中討論。

在組織破壞后，蒜氨酸酶與S-2-丙烯- L-半胱氨酸亞砜(ASCOs)反應(yīng)并裂解其C-S鍵，獲得次磺酸、丙酮酸和氨。眾所周知不穩(wěn)定的次磺酸根據(jù)非酶途徑(自縮合反應(yīng)產(chǎn)生硫代亞磺酸鹽)和酶機制(例如1-丙烯基亞磺酸催淚因子合成酶(LFS)導(dǎo)致丙硫醛-S-氧化物，最后在水的存在下形成丙醛)進行額外的化學(xué)反應(yīng)。簡而言之，一系列有助于產(chǎn)生香氣(氣味感覺、口感)和蔥屬植物生物活性的含硫有機化合物是在沒有催化次磺酸轉(zhuǎn)化的酶的情況下，從次磺酸中自發(fā)獲得的[59,61]。圖7顯示了(+)-S - 烷烴(烯烴)基半胱氨酸亞基(CSOs)中硫化物的形成過程，顯示了向催淚因子(在洋蔥中，即丙硫醛-S-氧化物)的反應(yīng)途徑，以及導(dǎo)致多硫化物和硫代磺酸鹽的簡化路徑。

圖7    半胱氨酸亞砜(CSOs)在組織破壞后的轉(zhuǎn)化。LFS-催淚因子合成酶[61]。

4. 揮發(fā)性硫化合物的主要基團

4.1.異硫氰酸酯(ITCs)

近年來，人們對ITCs的認識有了顯著提高。由于對人類健康和研究的興趣日益增長，有可能了解這些化合物的許多有利的性質(zhì)。大多數(shù)關(guān)于ITCs性質(zhì)的研究都關(guān)注于其化學(xué)預(yù)防和化療作用[62]。此外，其作為抗菌成分也已被證實，可用于農(nóng)業(yè)植物保護和食品保存[63]。其抗炎作用也已經(jīng)分別進行了研究，例如烯丙基ITC[64]和芐基ITC[65]。

雖然硫代葡萄糖是不揮發(fā)和無味的前體；對于其水解產(chǎn)物ITCs[66]，蕓苔屬蔬菜的刺激性風(fēng)味與ITCs的存在有關(guān)[67]。ITCs有多種獨特的香氣。化學(xué)結(jié)構(gòu)與氣味閾值之間存在一定的關(guān)系。隨著脂肪族分子中碳原子數(shù)量的增加，氣味閾值降低，但乙基ITC的氣味閾值高于甲基ITC。ITCs的化學(xué)結(jié)構(gòu)(如脂肪族飽和基團或不飽和基團、芳香、分枝、環(huán)和雜)不僅決定了氣味閾值，也決定了氣味質(zhì)量。ITCs描述的不明顯的氣味有甜的、水果的、花的、草藥的、蘑菇的，甚至還有魚味的。在所有記錄的氣味描述詞中，ITCs最常見的是硫、大蒜和刺激性氣味[68](圖8)。然而，對ITCs氣味的感官評估仍然有限，并沒有很多研究允許我們比較氣味質(zhì)量和閾值。

圖8  蔬菜中最常見的氣味描述物是異硫氰酸酯(綠色)[68]、腈和環(huán)硫腈(藍色)[26,61-64]

關(guān)于ITC味覺特性的數(shù)據(jù)通常非常有限，如果有的話。它們天然存在于復(fù)雜的食物基質(zhì)中，通常數(shù)量很多。ITC結(jié)合了它們的香氣和味覺的雙模態(tài)感知活動的文獻不多，使得關(guān)于它們在滋味形成中作用的許多問題沒有得到解答。硫代葡萄糖苷GLSs和異硫氰酸酯ITCs的定量測定和統(tǒng)計分析表明，只有部分化合物與苦味[41]之間存在相關(guān)性。

4.2.腈、環(huán)硫腈

腈類和環(huán)硫腈類是通過不穩(wěn)定苷元在特定輔助因子(如腈類特異蛋白(NSP)、上皮硫特異蛋白(ESP)或特定環(huán)境條件下的重排而產(chǎn)生的[69,70]。腈類和環(huán)硫腈類的存在與十字花科作物的食用部位和生長階段顯著相關(guān)。異硫氰酸酯(ITC)是最豐富的硫代葡萄糖苷(GLS)水解產(chǎn)生的，如白球甘藍、薩沃伊卷心菜或球芽甘藍可食用部分的葉子，而腈類和環(huán)硫腈類主要在甘藍的芽和種子中大量存在[71]。

白球甘藍

薩沃伊卷心菜

球芽甘藍

盡管在科學(xué)報告中，職業(yè)接觸腈通常與許多危害健康的疾病(如心血管、胃腸道、肝臟、神經(jīng)和腎臟)有關(guān)[72]，但食源性腈也顯示出潛在的細胞毒性和基因毒性[73]。蕓苔屬植物中腈的存在可能與促進健康的作用有關(guān)[74]。與ITC及其生物活性相比，人們對腈的了解相對較少。由于與ITC相比，腈的促進健康的活性降低，因此采用了一些策略來選擇特定的蔬菜品種。它們的特征要么是降低ESP的活性，要么是提高原生酶芥子酶的活性[70]。

目前已知芥子油苷水解反應(yīng)存在于十字花科植物及其昆蟲食草動物中。在完整的植物中，芥子苷和芥子酶是分開儲存的。當組織受損時，這兩種成分發(fā)生接觸，黑芥子酶將硫代葡萄糖苷水解為葡萄糖和不穩(wěn)定的葡聚糖，后者自發(fā)重新排列形成ITCs和/或腈。在植物上皮硫特異蛋白(ESP)存在的情況下，側(cè)鏈末端有一個雙鍵的硫代葡萄糖苷被水解為環(huán)硫腈類，其他硫代葡萄糖苷被水解為簡單腈。在植物硝酸酯指示蛋白(NSP)的存在下也主要形成腈類，而硫氰酸酯則由某些硫氰酸酯形成硫氰酸酯，硫氰酸酯形成硫氰酸酯蛋白(TFP)的存在下，以含硫氰酸酯植物為食的鱗翅目幼蟲具有特殊的生化適應(yīng)能力。小菜蛾和小恙蟲幼蟲通過硫代葡萄糖苷硫酸酯酶(GSS)對硫代葡萄糖苷進行脫硫，使其不再被黑芥子酶作為底物。菜青蟲幼蟲的NSP將水解重定向為簡單腈。

與相應(yīng)的醛相比，腈作為揮發(fā)性化合物具有與相應(yīng)醛相似的氣味[75]。蔬菜中發(fā)現(xiàn)的腈和環(huán)硫腈具有不同的香味，從令人愉悅的草味、草藥味、肉湯味到令人難以接受的氣味，如刺鼻的、硫磺味或汗味。圖8總結(jié)了蔬菜中發(fā)現(xiàn)的腈和環(huán)硫腈最常見的描述符。

考慮到腈類化合物的味道是未知的，學(xué)者們還不能確定腈類衍生物如何影響主要蔬菜的味道，如果有的話。目前，我們還沒有數(shù)據(jù)表明腈和環(huán)硫腈[41]的苦味達到什么程度。因此，需要進一步的研究，特別是對這些GLS水解產(chǎn)物的感官分析和口感評價。

4.3.硫化物和聚硫化物

食物樣品中硫化物揮發(fā)物的存在通常與令人不快和不可接受的氣味有關(guān)。事實上，花椰菜排異反應(yīng)的原因是二甲基三硫和二甲基硫化物等氣味的存在[76]。高濃度的硫化物存在于十字花科和十字花科的蔬菜中[77,78]。不同種類含有豐富有機硫化物的蔬菜具有很強的抗氧化活性，這些重要的生物活性化合物具有抗菌和免疫活性[79]。

硫化物在食品感官特性的創(chuàng)造中起著至關(guān)重要的作用，這就是為什么許多合成硫化物通常被用作食品香料(超過80種單硫化物、二硫化物和多硫化物)和加工食品添加劑[60]。硫化物也與許多其他產(chǎn)品的異味有關(guān)，如飲用水、酒精飲料和果汁[80-83]。硫化物的感官特性彼此相似，因為這些化合物通常以刺鼻的氣味和辛辣的味道為特征[26,84,85]。

4.4.硫醇和雜硫化合物

揮發(fā)性硫醇主要與各類食品和飲料中的異味有關(guān)[86,87]。在硫代葡萄糖苷的分解產(chǎn)物中，硫醇是決定蔬菜尤其是蕓苔類蔬菜氣味的重要化合物。研究表明，在生西蘭花中，甲硫醇和1-戊硫醇是風(fēng)味稀釋因子最高的兩種芳香活性化合物。更重要的是，硫醇可以被氧化成相應(yīng)的硫化物[88]。硫醇也在綠色大頭菜中被發(fā)現(xiàn)，但不是關(guān)鍵的風(fēng)味活性化合物[89]。植物對硫醇生物合成的調(diào)控意味著植物的氧化還原狀態(tài)與植物的耐受性有關(guān)；然而，到目前為止，有關(guān)硫醇的生物化學(xué)途徑還沒有被完全解釋[90]。

有趣的是，結(jié)構(gòu)中含有硫原子的芳香活性化合物是在松露和香菇中發(fā)現(xiàn)的氣味劑，其中揮發(fā)性化合物通過酶和非酶的方式形成。香菇產(chǎn)生香氣的化合物來自脂肪酸途徑和氨基酸途徑。亞麻酸和亞油酸是脂肪酸途徑的前體。它們被脂氧合酶、過氧化氫裂解酶和醇脫氫酶——轉(zhuǎn)化為醛和醇(主要是C6、C8和C9揮發(fā)物)。含硫氨基酸的多步氧化和聚合提供了前體物質(zhì)，即香菇酸，香菇酸是在酶存在下形成雜環(huán)硫揮發(fā)物的前體物質(zhì)，特別是γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶和CSO裂解酶[91]。從香菇中獲得的硫揮發(fā)物產(chǎn)生獨特的硫香味，與1,2,4-三硫烷、1,2,4,6-四硫烷和香菇精(lenthionine)的存在有關(guān)[92]。然而，在松露中，含硫揮發(fā)物的來源是復(fù)雜的，同時也不清楚。芳香活性化合物可能來自于松露本身，也可能來自于居住在松露子實體中的微生物群。有機揮發(fā)性化合物是生物合成的，主要通過硫酸鹽還原、氨基酸和脂肪酸分解代謝途徑[93,94]。

香菇精(lenthionine)是一種環(huán)狀有機硫化合物，存在于香菇中，部分貢獻了香菇的味道。其形成機制尚不清楚，但可能與C-S裂解酶有關(guān)。

在許多蔬菜、香菇和松露中都發(fā)現(xiàn)了一種有趣的香味化合物，它就是甲硫基丙醛。生物合成從氨基酸甲硫氨酸開始，經(jīng)Strecker降解轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸，其中美拉德反應(yīng)的中間體與甲硫氨酸相互作用。甲硫基丙醛(Methional)是一種結(jié)構(gòu)中含有硫原子的揮發(fā)性化合物，其特征是檢測閾值低，其氣味的屬性被定義為令人愉快，讓人聯(lián)想到煮熟的土豆。此外，甲硫基丙醛還可進一步轉(zhuǎn)化為硫化物和二硫化物化合物[95,96]。表S1(補充文件)列出了主要的芳香硫化合物及其氣味屬性，代表蔬菜和蘑菇中的不同類別。

甲硫基丙醛