桉葉醇的分子結(jié)構(gòu)式

桉葉油醇（1, 8-Cineole; Cajeputol; Eucalyptol）又名桉葉醇、桉樹腦、桉葉油醇等，是無色油狀透明液體，廣泛存在于天然芳香油中，為桉葉油的主要成分。桉葉油醇有樟腦氣息和清涼的草藥味道，具有殺菌和殺蟲作用，多用于醫(yī)藥和食品香料，還常用作防腐劑。無色至淡黃色油狀透明液體。沸點176℃，熔點1～1.5℃，凝固點1℃，閃點47～48℃。溶于乙醇、乙醚、氯仿、冰醋酸、丙二醇、甘油和大多數(shù)非揮發(fā)性油，微溶于水。天然品存在于桉葉油等200余種天然精油中。

生產(chǎn)方法

桉樹腦廣泛存在于天然芳香油中，為桉葉油的主要成分。桉樹腦可以芳香油中單離制得。例如將桉葉油分餾，收集175-180℃餾分，稍加精制即可。如需制造純度較高的產(chǎn)品，可將芳香油中分餾得到的桉樹腦加以冷卻，通入HCI干燥。分離出鹽酸及桉樹腦結(jié)晶，用熱水分解結(jié)晶，再經(jīng)精餾即得純粹的桉樹腦。

圖1 蒸汽蒸餾法用單獨的鍋爐提取藍桉精油 [1]

合成法是將萜品轉(zhuǎn)化成酸，再脫水而得。生產(chǎn)方法由桉葉油、藍桉油等含桉葉醇較多的精油，取170～180℃精餾分，經(jīng)冷凍或在冷凍下分餾單離而得。具體步驟如下：

松油醇合成桉葉油醇的方法，包括如下步驟：1) 將松油醇與二氯甲烷質(zhì)量比為1:13，松油醇與固體催化劑三氟甲磺酸鋅質(zhì)量比為1:10.4加入到反應(yīng)瓶中；常溫常壓下，在氮氣保護下用攪拌器攪拌4h，轉(zhuǎn)速為80轉(zhuǎn)/min，至反應(yīng)結(jié)束后靜置25min，得到反應(yīng)溶液Ⅰ；2) 在反應(yīng)溶液Ⅰ中加入二氯甲烷，松油醇與二氯甲烷質(zhì)量比為1:6，用攪拌器攪拌1h，轉(zhuǎn)速為40轉(zhuǎn)/min，得到反應(yīng)溶液Ⅱ；3) 在反應(yīng)溶液Ⅱ加入飽和碳酸氫鈉溶液進行萃取，松油醇與飽和碳酸氫鈉溶液質(zhì)量比為1:19，靜置分層10min，取下層溶液，得到反應(yīng)溶液Ⅲ；4) 用飽和食鹽水洗滌反應(yīng)溶液Ⅲ，松油醇與飽和食鹽水質(zhì)量比為1:14.4，洗滌分3次進行；加入無水硫酸鈉干燥，松油醇與無水硫酸鈉質(zhì)量比為1:9.6；使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干得到淡黃色透明液體，即桉葉油醇溶液。經(jīng)GC檢測，計算得桉葉油醇轉(zhuǎn)化率為65.5％。

桉葉醇的生物合成

圖2 桉葉醇的生物合成路線 [2]

桉樹醇和其他萜類化合物是通過異戊二烯生物合成途徑在這些植物中產(chǎn)生的。該途徑首先由異戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)通過香葉酰二磷酸合酶(GPS)縮合得到香葉酰焦磷酸。在桉樹醇的生物合成過程中，香葉酰焦磷酸經(jīng)過焦磷酸的消除和環(huán)化形成α-松油基陽離子(圖2)。α-松油基陽離子反應(yīng)生成α-松油醇。α-松油醇轉(zhuǎn)化為桉油醇的反應(yīng)由1,8-桉油醇合成酶催化。[2]

毒性GRAS(FEMA): LD502480mg/kg(大鼠，經(jīng)口)。

使用限量FEMA(mg/kg)：軟飲料0.13；冷飲0.50；糖果15；焙烤食品0.50～4.0；膠姆糖190。適度為限(FDA§172．515，2000)。

用途1

GB2760一96規(guī)定為允許使用的食品用香料。主要用于止咳糖、人造薄荷等中。

用途2

是薰衣草油和穗薰衣草油的固有成分之一，是配制這類精油必用的香料。適量用于藥草型如薰衣草、新刈草和香薇型香精中，有增加新鮮感的效果。用于藥皂、噴霧劑或化妝品香精和其他衛(wèi)生用品，如牙膏等，有殺菌作用。工業(yè)制品中可用作不良氣息的掩蓋劑。也用于食用香精。

用途3

用于口腔劑香精的調(diào)配和醫(yī)藥產(chǎn)品的制造，作為食品添加劑，日本《食品添加物公定書》規(guī)定桉樹腦純度85%以上，不得用于加香以外的目的。用途廣泛用于醫(yī)藥，也用于配制牙膏香精等。

桉葉醇的藥理活性

1、青蒿精油和桉樹醇通過非毒性代謝途徑激活Nrf2-Keap1，促進APAP清除，從而預(yù)防對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷

長期以來，在東亞，青蒿一直被用于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，并作為不同功能的食物來源。蒿屬植物(Artemisia vulgaris L.， AV)是蒿屬植物的一種。采用亞臨界丁烷萃取法從AV中提取精油。采用電子鼻頂空固相微萃取-氣相色譜法(HS-SPME-GC-MS)檢測EO含量。為探討桉樹醇和桉樹油對小鼠肝損傷的保護作用。單獨使用對乙酰氨基酚(APAP)可導(dǎo)致嚴重的肝損傷，其特點是血清AST和ALT水平顯著升高，ROS和肝臟丙二醛(MDA)水平顯著升高，肝臟超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)耗損。EOs顯著減輕apap誘導(dǎo)的肝臟損傷。進一步研究證實桉樹醇是Keap1的抑制劑，桉樹醇與Keap1的親和力KD為1.42 × 10e?5，增加了Nrf2從細胞質(zhì)向線粒體的轉(zhuǎn)運。激活的Nrf2增加尿苷二磷酸葡萄糖醛基轉(zhuǎn)移酶(UGTs)和磺基轉(zhuǎn)移酶(sulfotransferases)的mRNA表達，抑制CYP2E1的活性。因此，激活的Nrf2抑制毒性中間物的形成，促進APAP肝非毒性，使APAP代謝成APAP-gluc和APAP- sulc。總的來說，桉樹醇可以促進APAP的無毒代謝，從而保護肝臟免受APAP誘導(dǎo)的損傷，這表明桉樹醇或EOs可能是一種天然的肝保護劑。[3]

圖3 青蒿油及桉油醇抗肝損傷的機理 [3]

與苦艾屬(A. absinthium)、尼羅河蒿屬(A. nilagirica)和荒漠蒿屬(A. deserti)相比，AV是一種著名的蒿屬植物。AV-EOs富含桉葉醇和順式-β-松油醇，具有抗炎和抗氧化作用，可對抗多種疾病，包括呼吸系統(tǒng)疾病、胰腺炎、結(jié)腸損傷和非酒精性脂肪性肝炎。在我們的研究中，AV-EOs和桉樹醇顯著減輕了APAP過量(300 mg/kg)，并誘導(dǎo)了血清轉(zhuǎn)氨酶和肝臟組織病理學(xué)損傷的增加(圖3)，表明AV-EOs具有預(yù)防APAP引起的肝毒性的能力。[3]

許多關(guān)于青蒿的研究并未在食物/水消耗量、體重、死亡率、血液學(xué)、血清生化、器官重量和組織病理學(xué)方面造成任何顯著的不良影響；高劑量(752 mg/kg)使用青蒿可能會因誘變和肝毒性而對健康造成危害，這表明不建議將青蒿提取物高劑量應(yīng)用于嚴重疾病的治療。青蒿可能有神經(jīng)毒性；由于側(cè)柏酮(thujone)的主要活性，它能以劑量依賴的方式抑制γ -氨基丁酸A (GABAA)受體引起的興奮和驚厥。在我們的研究中，AV-EOs不含側(cè)柏酮，而青蒿揮發(fā)油的劑量低于毒性劑量。實驗結(jié)果表明，普通青蒿揮發(fā)油(5%,100 ml/kg)對小鼠肝臟無明顯的損傷作用。APAP組肝臟指數(shù)顯著高于對照組，而APAP-EO (AV)、EO與對照組肝臟指數(shù)無顯著差異。與EO治療后的EOs化合物及肝功能指標比較，我們推測低劑量的AV是安全的。[3]

APAP在肝臟中具有無毒和有毒的代謝途徑。在無毒途徑中，在UGT和SULT家族的參與下，APAP被葡萄糖醛酸化和硫酸酸化為APAP-gluc和APAP- sulc，并排泄到血液和膽汁中。本研究中，桉樹醇處理后，UGT1A1、UGT1A6、UGT1A9、SULT1A1和SULT2A1水平顯著升高，表明桉樹醇通過無毒途徑促進APAP代謝。Nrf2基因，在TGAG/CNNNGC (N代表任何堿基)的共識下，是誘導(dǎo)UGT和SULT家族表達增加所必需的。桉樹醇顯著提高了Nrf2 mRNA的表達。桉樹醇可以直接與Keap1結(jié)合在Arg-415位點，即Nrf2-Keap1結(jié)合位點。桉樹醇對Keap1蛋白有較強的親和力。激活的Nrf2從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞核。Nrf2 mRNA的表達也增加，導(dǎo)致EO處理下核/胞質(zhì)相對表達增加。此外，Nrf2是一種調(diào)節(jié)內(nèi)源性抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄因子。EOs刺激Nrf2激活。被激活的Nrf2與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，進一步激活編碼抗氧化和解毒功能的基因轉(zhuǎn)錄，包括血紅素加氧酶-1 (HO-1)、NAD(P)H:醌氧化還原酶-1 (NQO-1)和谷胱甘肽合成酶[谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)] 。我們的研究結(jié)果表明，EOs增加了Nrf2從細胞質(zhì)向細胞核的轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致抗氧化酶(HO-1、SOD和CAT)和II期代謝酶(UGT和SULT)。[3]

APAP的第二代謝途徑為毒性反應(yīng)。過量的APAP通過CYP2E1轉(zhuǎn)移到NAPQI ，經(jīng)過化學(xué)和酶結(jié)合到GSH。毒性途徑可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化；抗氧化酶活性降低，活性氧水平升高。在這里，APAP使MDA和ROS水平升高，SOD和CAT活性降低，提示APAP誘導(dǎo)的肝功能障礙是由氧化應(yīng)激引起的。APAP顯著提高CYP2E1的表達，桉樹醇顯著降低CYP2E1的表達。CYP2E1缺陷小鼠對肝損傷誘導(dǎo)的APAP具有抗性，而人CYP2E1轉(zhuǎn)基因小鼠對APAP轉(zhuǎn)化為NAPQI具有敏感性。結(jié)果表明，桉樹醇可以抑制CYP2E1的表達，減輕肝損傷。途徑分析研究還報道了以下活性化合物:2-丁酮、3-甲基-、1-辛烯、苯甲醛、苯酚、4-甲基-、辛醛、1-壬烯和己醛。這些化合物分別是醛酮還原酶家族1成員C1、醇脫氫酶1B、細胞色素P450 2A6和細胞色素P450 1A2等有效靶標，它們通過細胞色素P450途徑和藥物代謝-細胞色素P450途徑參與外源性代謝，并與CYP2E1的表達有關(guān)。[3]

綜上所述，AV-EOs可以通過兩條途徑預(yù)防APAP誘導(dǎo)的肝損傷，一是下調(diào)CYP2E1的表達，使APAP血漿濃度降低而轉(zhuǎn)化為NAPQI；二是上調(diào)解毒途徑的表達。上調(diào)途徑包括與Keap1抑制結(jié)合，刺激Nrf2從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體，激活Nrf2，從而增加抗氧化酶(SOD、GSH、CAT、GPx)和II期酶(SULTs、UGTs)的活性(圖4)。從而降低APAP血漿濃度，促進APAP無害代謝。[3]

圖4 桉樹醇保護APAP肝損傷的機制 [3]

2、桉樹醇減輕炎癥和疼痛反應(yīng)的小鼠模型的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是由尿酸單鈉(MSU)晶體在關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)周圍組織的積累引起的，可引起嚴重疼痛，影響患者的生活質(zhì)量。桉樹醇(1,8-桉樹醇)是桉葉精油的主要成分，已知具有抗炎和鎮(zhèn)痛作用。本研究旨在探討桉樹醇對痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的治療作用及其機制。通過在踝關(guān)節(jié)內(nèi)注射MSU建立小鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。檢測踝關(guān)節(jié)水腫、機械異常痛、中性粒細胞浸潤、氧化應(yīng)激、NLRP3炎癥小體、TRPV1表達。桉樹醇劑量依賴性地減輕msu引起的機械疼痛和踝關(guān)節(jié)水腫，其效果與吲哚美辛相似。桉樹醇可減少踝關(guān)節(jié)組織炎癥細胞的浸潤。桉樹醇抑制MSU誘導(dǎo)的踝關(guān)節(jié)組織NLRP3炎癥小體激活和促炎細胞因子的產(chǎn)生。桉樹醇可降低MSU誘導(dǎo)的RAW264.7細胞和踝關(guān)節(jié)組織的氧化應(yīng)激，提高抗氧化酶活性，降低ROS水平。桉樹醇抑制msu誘導(dǎo)踝關(guān)節(jié)組織和支配踝關(guān)節(jié)的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中TRPV1表達上調(diào)。通過給小鼠注射抗氧化劑，模擬桉樹醇對踝關(guān)節(jié)水腫、機械痛、NLRP3炎癥小體、IL-1β和TRPV1表達的體內(nèi)作用。桉樹醇可減輕MSU引起的疼痛和炎癥，其機制可能與抗氧化作用有關(guān)。桉樹醇和其他抗氧化劑可能是治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的有前途的選擇。

圖5 桉樹精油的結(jié)構(gòu)和實驗規(guī)程。(a)桉樹醇的分子結(jié)構(gòu)。(b)體外實驗方案:RAW264.7細胞接種于六孔板。MSU刺激前20 min (0.5 mg·ml?1)使用0.1 ~ 10 μM的桉樹醇。細胞孵育4小時后，進行MTT或ROS檢測。(c)體內(nèi)實驗方案:踝關(guān)節(jié)注射MSU (0.5 mg/20 μl)或PBS (20 μl)建立痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型或?qū)φ战M。分別于造模后0、2、4、6、8、24、48 h測量機械過敏和踝關(guān)節(jié)水腫。分別于MSU注射前1小時和造模后5、23、47小時靜脈注射桉樹醇(30、100、300、600 mg·kg?1)、吲哚美辛(10 mg·kg?1)和對照品(玉米油)，共4次。建立模型24小時后處死小鼠，進行踝關(guān)節(jié)病理分析、MPO測定、qPCR、western blot和抗氧化活性測定

在本研究中，我們觀察了桉樹醇在MSU誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎小鼠模型中的抗炎鎮(zhèn)痛作用，并將其與常用的治療痛風(fēng)的非甾體抗炎藥吲哚美辛(indomethacin)進行了比較。我們發(fā)現(xiàn)桉樹醇能有效減輕MSU引起的機械疼痛、踝關(guān)節(jié)水腫和踝關(guān)節(jié)組織中性粒細胞浸潤，其效果與吲哚美辛相似。體內(nèi)研究表明，桉樹醇抑制MSU誘導(dǎo)的踝關(guān)節(jié)組織NLRP3炎癥小體的激活和促炎細胞因子的產(chǎn)生。此外，桉樹醇還能降低MSU誘導(dǎo)的RAW264.7細胞和踝關(guān)節(jié)組織的氧化應(yīng)激。MSU可上調(diào)局部踝關(guān)節(jié)組織和DRG神經(jīng)元中TRPV1的表達，桉樹精可顯著降低TRPV1的表達。我們進一步發(fā)現(xiàn)，桉樹醇對踝關(guān)節(jié)水腫、機械痛、NLRP3炎癥小體、IL-1β和TRPV1表達的體內(nèi)影響是通過給MSU注射抗氧化劑來模擬的。

桉樹醇已被證明在幾種炎癥條件下具有明顯的抗炎作用，包括哮喘、結(jié)腸炎、吸煙引起的急性肺部炎癥和流感病毒誘導(dǎo)的感染。桉樹醇還具有多種疼痛條件下的鎮(zhèn)痛作用，包括神經(jīng)性口面部疼痛和TRPA1通道IL-6應(yīng)用引起的疼痛，對人類皮膚的激動劑。通過與TRPM8通道的相互作用，我們發(fā)現(xiàn)桉樹醇對lps誘導(dǎo)的肺部炎癥具有抗炎作用，對CFA誘導(dǎo)的炎癥性疼痛小鼠模型以及乙酸誘導(dǎo)的內(nèi)臟疼痛有鎮(zhèn)痛作用。本研究發(fā)現(xiàn)桉樹醇能有效緩解MSU誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎小鼠模型的炎癥和疼痛。目前還沒有關(guān)于桉樹醇治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的報道。因此，我們的工作提供了第一個證據(jù)表明桉樹醇治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。

MSU晶體觸發(fā)NLRP3炎癥小體的激活。NLRP3炎癥小體由一系列蛋白質(zhì)組成，包括NLRP3/ASC/caspase-1，它們負責(zé)前IL-1β分裂成活性IL-1β。一方面，IL-1β促進炎癥部位中性粒細胞的招募，誘導(dǎo)痛風(fēng)性炎癥。另一方面，IL-1β使外周感覺神經(jīng)系統(tǒng)的痛覺感受器敏感或直接激活，引起強烈的疼痛。使用中和抗體阻斷IL-1β可顯著緩解痛風(fēng)。因此，NLRP3炎癥小體的激活在msu誘導(dǎo)的痛風(fēng)疼痛和炎癥的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用。我們的數(shù)據(jù)表明，桉樹醇顯著降低了msu誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎小鼠踝關(guān)節(jié)組織NLRP3、caspase-1和IL-1β的表達。這些結(jié)果表明桉樹醇可能通過抑制NLRP3炎癥小體的激活來緩解msu誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。

我們進一步研究了桉樹醇抑制NLRP3炎癥小體的機制。有證據(jù)表明，ROS的產(chǎn)生激活了NLRP3炎癥小體，而ROS清除物阻斷了NLRP3炎癥小體的激活。MSU通過ros依賴的方式誘導(dǎo)NLRP3的激活。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)MSU在體外和體內(nèi)踝關(guān)節(jié)組織巨噬細胞RAW264.7細胞中誘導(dǎo)ROS生成顯著增加。桉樹醇已經(jīng)被報道在一些研究中發(fā)揮抗氧化作用。實驗結(jié)果表明，桉樹醇可降低msu誘導(dǎo)的RAW264.7細胞中ROS的生成，并可通過降低MDA的生成、恢復(fù)SOD和GSH的活性以及上調(diào)踝關(guān)節(jié)炎癥組織中Nrf2的表達來發(fā)揮抗氧化作用。為了了解減少ROS是否能導(dǎo)致痛風(fēng)條件下NLRP3炎癥小體激活的抑制，我們研究了兩種成熟的抗氧化劑NAC和Tempol在注射msu小鼠中的作用。最近有報道稱，抗氧化劑可以在體外抑制MSU誘導(dǎo)的THP-1細胞系NLRP3炎癥小體的激活和IL-1β的產(chǎn)生。我們發(fā)現(xiàn)，NAC和Tempol都能減少msu處理小鼠體內(nèi)踝關(guān)節(jié)組織中MDA的過剩生成，并恢復(fù)內(nèi)源性抗氧化劑，其程度與桉樹醇相似。更重要的是，NAC和Tempol降低了msu注射小鼠的NLRP3炎癥小體激活、IL-1β的產(chǎn)生和TRPV1通道過表達，與桉樹精的作用類似。因此，我們的數(shù)據(jù)為桉樹醇對msu誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的抗氧化作用提供了證據(jù)，并進一步提供了體內(nèi)證據(jù)，表明桉樹醇可能通過抗氧化作用機制抑制NLRP3炎癥小體的激活。

我們發(fā)現(xiàn)，在msu誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)組織中，TRPV1通道的表達顯著上調(diào)，這與之前的報道一致。TRPV1通道拮抗劑可減少msu誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)液中的疼痛反應(yīng)以及關(guān)節(jié)腫脹、血漿外滲、白細胞浸潤和IL-1β的產(chǎn)生。TRPV1陽性感覺神經(jīng)元的脫敏顯著降低了msu誘導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的疼痛和關(guān)節(jié)水腫，表明TRPV1神經(jīng)通道在介導(dǎo)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的疼痛和炎癥中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。已經(jīng)證實，TRPV1通道的表達可以通過一系列促炎細胞因子(包括IL-1β、IL-6和TNF-α)上調(diào)，從而導(dǎo)致疼痛的維持和加重。在這里，我們發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-6和TNF-α在msu處理小鼠踝關(guān)節(jié)組織中的表達均增加，這可能導(dǎo)致我們等觀察到的TRPV1上調(diào)。此外，我們發(fā)現(xiàn)桉樹醇治療顯著降低了踝關(guān)節(jié)組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的過表達。通過抗氧化活性消除ROS可以降低NLRP3炎癥小體的激活，從而減少IL-1β的釋放。因此，這些影響可能導(dǎo)致在痛風(fēng)條件下桉樹醇表達TRPV1通道的衰減。

總之，我們提供的證據(jù)表明，桉樹醇可以降低msu誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、NLRP3炎癥小體激活、促炎細胞因子的產(chǎn)生和TRPV1過表達。進一步證明桉樹醇可減輕msu引起的疼痛和炎癥，其機制可能與桉樹醇的抗氧化作用有關(guān)。桉樹醇和其他抗氧化劑可能代表有前途的治療方案痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎的口服藥劑。

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